Label-free是一種非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，不需使用同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，直接根據(jù)肽段質(zhì)譜峰的強(qiáng)度對蛋白進(jìn)行相對定量。

不同樣本提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，取等量蛋白分別進(jìn)行胰酶酶解，之后純化的各組肽段分別做LC-MS/MS分析；采用特定軟件檢索原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，解析出不同樣本中各個肽段的定量信息，進(jìn)而獲得蛋白質(zhì)在不同樣本中的定性和定量信息

1、蛋白鑒定和定量；
2、差異蛋白的篩選和鑒定。

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1.Hervé V. et al:Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. The Plant Cell.2014，IF=9.618. 【研究內(nèi)容】：木薯是熱帶地區(qū)最重要的塊根作物，但木薯采后生理快速退化（PPD）是制約木薯商品化生產(chǎn)的主要原因。研究者建立了一種基于圖像的PPD癥狀量化方法，并使用Label Free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在木薯根中鑒定出2600多個獨特的蛋白質(zhì)，其中近300個蛋白質(zhì)在PPD過程中表現(xiàn)出顯著的豐度調(diào)節(jié)。基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、酶活性和脂質(zhì)過氧化檢測，最終確定谷胱甘肽過氧化物酶是降低PPD的候選藥物。 使用技術(shù)：label free定量蛋白組分析、Label-free實驗外包服務(wù)

2.Brian D.et al:Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727(Volasertib) in BRAF V600E Mutant Melanoma Cells. Journal of Proteome Research.2015，IF=4.074. 【研究內(nèi)容】：Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種人類癌癥中過表達(dá)，對持續(xù)的致癌增殖至關(guān)重要。為了更好地了解Plk1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，研究者利用Label Free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)Plk1特異性抑制劑BI 6727處理人黑色素瘤A375細(xì)胞后，多個蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化。此外，研究者還通過異質(zhì)核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)確定了Plk1和p53之間的新關(guān)聯(lián)，從而為Plk1在癌細(xì)胞存活中的作用提供了有價值的見解。 使用技術(shù)：label-free 質(zhì)譜、Label free非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)、LabelFree定量實驗檢測

蛋白組/代謝組實驗

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實驗檢測服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實驗

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實驗

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

?熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實驗服務(wù)

?miRNA靶基因驗證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實驗試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

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輝駿實力

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中文標(biāo)題：小分子抑制劑BI 6727對BRAFV600E突變黑色素瘤細(xì)胞Polo樣激酶1抑制作用的大規(guī)模非標(biāo)記比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析

發(fā)表期刊：Journal of proteome research

影響因子：4.074

運(yùn)用技術(shù)：Label Free非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué) （由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 內(nèi)容概述

Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過調(diào)節(jié)有絲分裂的進(jìn)入、進(jìn)展和退出，在多種人類癌癥中過表達(dá)，對持續(xù)的致癌增殖至關(guān)重要。本研究通過利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略來比較Plk1特異性抑制劑BI 6727處理后BRAFV600E突變黑色素瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，利用無標(biāo)記納米LC?MS/MS技術(shù)在Q-Exactive上進(jìn)行篩選，鑒定了20多個感興趣的蛋白；并通過乳酸和NAD水平來評估與細(xì)胞代謝相關(guān)的降低。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)了多個蛋白酶體亞基的下調(diào)，導(dǎo)致20S蛋白酶體活性顯著降低。有關(guān)異質(zhì)核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)的檢測也進(jìn)一步確定了Plk1和p53之間的新關(guān)聯(lián)，從而為Plk1在癌細(xì)胞存活中的作用提供了有價值的見解。

● 研究路線

● 研究結(jié)果

1. BI 6727處理、蛋白質(zhì)鑒定、定量和分析

為確定Plk1在黑色素瘤中的下游分子機(jī)制，研究者闡明了BI 6727抑制Plk1后人黑色素瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組的定量變化。使用Label Free方法進(jìn)行分析，為準(zhǔn)確確定蛋白質(zhì)比例，每種樣本類型設(shè)置了三個以上的實驗重復(fù)。該方法識別出1800多種蛋白質(zhì)，其中343種被識別的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化。

接下來，研究者使用Panther(通過進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行蛋白質(zhì)分析)來評估集體蛋白質(zhì)的分子功能，并確定催化活性和結(jié)合是主要的蛋白質(zhì)功能(圖2C)。

2. BI 6727治療改變多種代謝蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，Plk1活性的抑制導(dǎo)致多種代謝蛋白的表達(dá)減少，包括蘋果酸脫氫酶1(MDH1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)和轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)。此外，Western blot結(jié)果證實了乳酸脫氫酶A(LDHA)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)和乳酸脫氫酶B(LDHB)顯著降低(圖3A)。有趣的是，LDHA、LDHB和GPI均在糖酵解中扮演著重要的角色。推測Plk1的過表達(dá)可能有助于癌癥相關(guān)的從線粒體氧化磷酸化OXPHOS向有氧糖酵解的轉(zhuǎn)換。

為了評估Plk1抑制對有氧糖酵解的影響，研究者分別測量了細(xì)胞外乳酸的水平，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的水平，乳酸是葡萄糖分解的主要副產(chǎn)品，而NADH和NADPH是糖酵解和磷酸戊糖途徑分解葡萄糖過程中產(chǎn)生的酶輔助因子。結(jié)果顯示兩個治療組(25 NM和100 NM)的乳酸水平與對照組相比顯著降低(圖3C)。在BI-6727處理的細(xì)胞中，NADH和NADPH水平顯著降低，幾乎降低了5倍(圖3D)。這些數(shù)據(jù)表明，Plk1抑制后NAD+的下降幅度更大，鑒于丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化是NAD+再生的主要途徑，有理由預(yù)測LDHA的下降是比率變化的主要因素。

3. BI 6727治療導(dǎo)致多個20S蛋白酶體亞基下調(diào)

 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過一個系統(tǒng)過程對細(xì)胞內(nèi)80%~90%的蛋白質(zhì)降解起著不可或缺的作用。在比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，研究者發(fā)現(xiàn)BI6727治療導(dǎo)致人黑色素瘤細(xì)胞中多個20S亞基的顯著下調(diào)。進(jìn)一步擴(kuò)大IPA分析范圍，發(fā)現(xiàn)20S亞基α7和β6分別下調(diào)了2.46%和5.56%(圖4B)。使用熒光團(tuán)標(biāo)記的蛋白酶體底物檢測了20S蛋白酶體的活性，檢測顯示，與對照組相比，BI 6727處理細(xì)胞的20S活性顯著降低(圖4D)。

4. 異質(zhì)性核糖核蛋白C1/C2在BI 6727治療后上調(diào)

異質(zhì)性核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)是一種普遍存在的RNA結(jié)合蛋白，主要以hnRNPC1和hnRNPC2兩種異構(gòu)體表達(dá)。最近的一項研究表明，HNRNPC過表達(dá)通過抑制有絲分裂蛋白極光激酶B(AurkB)在肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞中誘導(dǎo)微核。Plk1活性的抑制可能會對AurkB的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響，與Plk1抑制相關(guān)的有絲分裂可能部分通過HNRNPC和AurkB介導(dǎo)。此外，HNRNPC被證明通過直接與p53 mRNA 5‘編碼區(qū)的順式元件結(jié)合來促進(jìn)p53的翻譯。研究者分別通過Western blot和p21的轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)p53蛋白的表達(dá)和活性相應(yīng)地增加(圖5E)。這些數(shù)據(jù)為Plk1通過調(diào)節(jié)HNRNPC介導(dǎo)的p53表達(dá)提供了令人信服的證據(jù)。

● 結(jié)論

對BI 6727抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞Plk1的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多個蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化，這些蛋白尚未被確定為Plk1信號網(wǎng)絡(luò)的一部分。蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了Plk1和HNRNPC之間一種新的關(guān)系的證據(jù)，并且Plk1抑制對厭氧糖酵解和蛋白酶體活性有相當(dāng)大的影響，這兩條途徑是癌細(xì)胞生存所必需的。這些數(shù)據(jù)為新的Plk1信號通路和未來靶向治療的潛在候選者提供了堅實的基礎(chǔ)。