中文標題：MEX3A/circMPP6復合體通過抑制自噬促進結直腸癌發展

發表期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy

中科院分區：1區

影響因子：40.8

發表時間：2024.04

合作單位：中山大學附屬腫瘤醫院

運用技術：IP MS結合蛋白鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

背景：

P小體（PBs）是細胞質中的一種無膜細胞器，也被稱為細胞質加工小體，通過液-液相分離(LLPS)形成，是由RNA和RBP組成的一個聚集體，其功能主要涉及?mRNA的降解和翻譯的抑制。

已知PBs穩態與缺氧、營養饑餓等多種應激密切相關，鑒于應激條件在腫瘤微環境中的重要作用，推測PBs形成的失調可能在腫瘤病理過程中發揮作用。mex3 RNA結合家族成員A (MEX3A)是一種RBP，與各種RNA代謝有關，包括mRNA穩定性、miRNA在細胞核和細胞質之間的轉運。越來越多的證據表明，MEX3A參與了多種癌癥的進展。circRNAs主要通過海綿作用microRNA或與RBP相互作用來發揮功能。此外，circRNAs可以作為蛋白質的誘餌、支架和招募者，影響蛋白質的相互作用或定位。

內容概述：

2024年4月，中山大學附屬腫瘤醫院的研究人員在國際期刊Signal Transduction and Targeted Therapy上發表新論文，描述了MEX3A在結直腸癌細胞惡性特性和自噬活性中的作用。研究結果表明，MEX3A經歷LLPS并協調活細胞中PBs成分的募集。circMPP6作為關鍵支架，促進了MEX3A和PBs組分之間的相互作用，進而促進了CRC細胞中PBs的形成。MEX3A/circMPP6復合物可以影響PDE5A mRNA的降解，從而引發CRC細胞的侵襲性。臨床上看，MEX3A表達高、PDE5A表達低的結直腸癌患者預后較差。總的來說，該論文揭示了RBP/circRNA復合物在調節PBs穩態中的重要作用，為結直腸癌患者的預后評估和治療干預提供了樂觀的前景。

研究路線：

1. 數據庫分析和表達檢測：MEX3A在CRC組織中顯著上調；

2. RIP-seq和功能檢測：MEX3A通過抑制自噬來促進CRC進展；

3. 結構分析和CoIP MS：MEX3A通過內在無序區(IRDs)經歷LLPS，并與MOV10、PABP1和UPF1相互作用形成PBs；

4. RIP和RNA Pull-down：circMPP6分別與MEX3A和PBs組分MOV10相互作用來促進CRC；

5. CoIP和RIP：circMPP6通過影響MEX3A-PBs組分的協作來促進PBs的維持；

6. RNA-Seq和RNA Pull-down：MEX3A/circMPP6招募了UPF1來啟動自噬關鍵蛋白PDE5A mRNA的降解，促進CRC發展。

研究結果：

1.    MEX3A在CRCs中高表達，促進CRC細胞惡性并抑制自噬

Cbiopportal (http://www.cbioportal.org)分析發現癌癥相關RBP“MEX3A”在人類CRC中顯著高表達(圖1a, b)。免疫組化(IHC)證實MEX3A在CRC組織中顯著上調(圖1c-e)，且與CRC臨床分期及T、N分期正相關，預示較差的患者總生存期(OS) (P < 0.05;圖1 f)。敲低或過表達MEX3的細胞和動物模型實驗發現，MEX3A加重了CRC進展。

為了尋找MEX3A的結合mRNA，作者在CRC細胞中進行RIP-seq。KEGG pathway表明結合RNA主要富集于FoxO自噬相關通路，提示MEX3A可能與CRC細胞自噬有關。進一步的實驗證明，在血清饑餓時，敲低MEX3A促進了自噬（自噬活性標志物LC3-II增加、自噬底物p62降解增加）；自噬溶酶體抑制劑氯喹(CQ)的處理阻斷了饑餓誘導的p62水平降低(圖1g)。mRFP-GFP-LC3自噬通量檢測顯示，敲低MEX3A導致CRC細胞中的自噬體和自溶體數量明顯增加(圖1i)，過表達結果與之相反。這些數據表明，MEX3A抑制自噬，從而促進CRC進展。

圖1

2.    MEX3A依賴內在無序區形成PBs，且與PBs組分蛋白相互作用

IUPred2A工具(http://iupred2a.elte.hu)預測到MEX3A蛋白有幾個內在無序區(IRDs) (圖2a)，可能導致相分離液滴的形成，因此構建了MEX3A全長和兩個截短突變質粒，分別在體外和體內條件下驗證此推論(圖2b)。體外條件下，全長MEX3A蛋白溶液在4°C時透明，隨溫度升高至37°C逐漸不透明(圖2c)。溶液中MEX3A和NaCl濃度的升高會增加微米級液滴的大小和數量(圖2d)。截短IDRs的液滴大小和數量顯著增加，刪除IDRs不能觀察到液滴(圖2c, d)。當EGFP-MEX3A及其突變體質粒轉染CRC細胞后，EGFP-MEX3A在細胞質中呈離散點狀分布，光漂白后熒光恢復(FRAP)實驗觀察到液滴都在光漂白后6 min內恢復了70%；EGFP-MEX3A-IDRs在細胞質中出現大量液滴狀凝聚物，在光漂白后6 min內恢復了90%；EGFP-MEX3A-IDRs△組僅有少量液滴，且在光漂白后無法恢復 (圖2e-f)。此外，IDRs缺失還減弱了因MEX3A過表達導致的皮下腫瘤生長。這些結果表明，MEX3A的IDRs是其LLPS和促進CRC腫瘤發生所必需的。

293T細胞的免疫共沉淀（Co-IP）和質譜（LC-MS/MS）篩選了MEX3A的相互作用蛋白，發現了MOV10、UPF1、DDX6和PABP1等幾個PBs相關RBP (圖2g)。coip和免疫熒光(IF)實驗驗證了MEX3A與MOV10、PABP1和UPF1之間的結合(圖2h-i)，表明MEX3A蛋白是PBs的一個組成部分。

圖2

3.    PBs中的MEX3A與circMPP6結合

鑒于PBs是由關鍵蛋白和RNA的局部高濃度引起的，作者進行了MEX3A蛋白的RIP實驗和小RNA測序來篩選PBs穩態相關的circRNA。結合CircInteractome工具(https://CircInteractome.nia.nih.gov/)對MEX3A和MOV10蛋白的結合circRNA的預測，選定circ_0001686（也叫circMPP6）做進一步研究(圖3a)。Sanger測序驗證了其反向剪接連接位點(圖3b)，FISH表明circMPP6在細胞質呈點狀分布(圖3c)。RIP和RNA Pull-down發現circMPP6與MEX3A和PBs核心成分MOV10相互作用(圖3d)。MEX3A、MOV10和circMPP6在胞質共定位，并且嘌呤霉素(一種刺激PBs形成的藥物)的處理加速了circMPP6和MEX3A在細胞質的富集(圖3f)。此外，過表達circMPP6大大增加了CRC細胞的增殖和遷移能力，其功能與MEX3A相似。這些結果表明circMPP6是MEX3A發揮作用的中間因子，MEX3A/circMPP6復合物的形成與CRC細胞中PBs的形成密切相關。

圖3

4.    circMPP6通過加強MEX3A-PBs組分的相互作用促進PBs聚集

circMPP6如何調節MEX3A的功能呢？已知MEX3A參與泛素化，circRNAs也可以調節蛋白降解，但敲低circMPP6不影響MEX3A及PBs組分的蛋白水平。當嘌呤霉素處理后，缺乏MEX3A/circMPP6可導致PBs解離，而細胞質中存在MEX3A和circMPP6融合體(圖4a)，推測MEX3A/circMPP6復合物可能調節PBs的組裝。在sh-circMPP6-CRC細胞中進行等量MEX3A蛋白的IP實驗，MOV10、PABP1和UPF1的豐度都減少了。蔗糖梯度沉降實驗發現：MOV10、PABP1和UPF1蛋白的分布相似(圖4b)，MEX3A的積累與受circMPP6調控的PBs蛋白組分有關。

為了鑒定MEX3A與circMPP6結合的結構域，構架了MEX3A突變體進行RIP實驗， 發現MEX3A的KH1和KH2結構域都與MEX3A/circMPP6復合物的形成有關(圖4c)，IP實驗證實MEX3A還通過KH2結構域與3個PBs組分蛋白結合(圖4d)。作者進行了挽救實驗，敲低MEX3A引起的自噬促進、轉移和增殖抑制可以被過表達野生型MEX3A(WT)所逆轉(圖4e-g)，但不能被過表達KH2缺失型MEX3A所逆轉，表明KH2結構域在MEX3A介導的結直腸癌侵襲性中起關鍵作用。RIP-Seq數據分析發現，CACU RNA序列是MEX3A的結合基序，而circMPP6的接口序列中存在CACU基序。RNA Pull-down和RNA-EMSA實驗都證明了circMPP6通過CACU基序與MEX3A結合。

這些結果都提示circMPP6通過影響MEX3A-PBs組分的協作來促進PBs的維持。

圖4

5.    MEX3A/circMPP6復合物促進PDE5A mRNA降解，調控CRC自噬

為了確定MEX3A的下游靶點，作者在對照和敲除MEX3A的CRC細胞中進行RNA-Seq，并結合MEX3A的RIP-Seq數據，找到了29個共有差異mRNA (圖5a)；再參考TCGA患者和CRC細胞的失調基因，最終得到10個候選基因。qRT-PCR和Flag-MEX3A-RIP確定了PDE5A、SENP7和TTLL7 mRNA受到MEX3A的調控和結合(圖5b, c)。RNA Pull-down實驗也顯示circMPP6與這三種mRNA相互作用(圖5d)。RIP-qPCR表明PBs組分MOV10和UPF1可以PDE5A mRNA結合 (圖5e)。此外，在敲低MEX3A/circMPP6后，CRC細胞中PDE5A、SENP7和TTLL7 mRNA的穩定性顯著增強(圖5f)，表明MEX3A/circMPP6復合物介導的PBs聚集影響mRNA的降解。由于MEX3A抑制自噬進程，因此PDE5A被確定為MEX3A的潛在靶點。

已知UPF1觸發PBs的mRNA降解，作者推測MEX3A/circMPP6復合體可能招募UPF1啟動PDE5A mRNA降解。通過RIP-qPCR和IF-RNA FISH實驗證實了MEX3A/circMPP6的敲低顯著降低了UPF1與PDE5A mRNA的結合，并且PDE5A mRNA的熒光強度增加(圖5g-h)，表明UPF1結合PDE5A mRNA并導致其降解的機制依賴于MEX3A/circMPP6復合體。

在敲低MEX3A的CRC細胞中再轉染PDE5A-shRNA時，明顯抑制了CRC的自噬(圖5i-k)，且促進了增殖和轉移。異種移植模型也發現PDE5A的下調逆轉了敲低MEX3A產生的腫瘤抑制作用(圖5I)，表明MEX3A在結直腸癌中的致癌作用依賴于PDE5A通路。

圖5

6.     MEX3A/circMPP6-PDE5A信號通路調控CRC發展

接下來，作者評估了MEX3A調控通路在結直腸癌患者中的臨床意義，在TCGA和SYSUCC數據集、以及8個匹配的CRC和鄰近非癌組織中，PDE5A的表達與MEX3A/circMPP6的水平呈負相關(圖6a-c)，并且高MEX3A和低PDE5A的CRC患者的OS最差(圖6d)。這些結果證實MEX3A上調可顯著減弱PDE5A的表達，從而在結直腸癌侵襲性和患者預后中發揮關鍵作用。

圖6

結論：

該論文揭示了RBP/circRNA復合物在調節PBs穩態中的重要作用：circMPP6作為一個支架，介導了MEX3A與三種PBs相關蛋白（MOV10、PABP1和UPF1）的相互作用，促進了CRC細胞中PBs的形成。MEX3A/circMPP6復合物可以影響PDE5A mRNA的降解，從而引發了CRC細胞的侵襲性。

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