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中文標題：FEN1 L209P突變干擾長斑塊堿基切除修復并誘導細胞轉化

發表期刊：Oncogene

中科院分區：1區

影響因子：8.756

發表時間：2016年6月

合作單位：南京師范大學

運用技術：載體構建（由輝駿生物提供技術支持）

● 研究背景

基因組DNA不斷暴露于內源性或外源性損傷中，從而導致DNA損傷。DNA損傷如果不修復，可能導致基因突變和隨后的基因組不穩定以及癌癥的發生。 DNA損傷的清除和基因組完整性的維持取決于強大的細胞DNA修復系統，而堿基切除修復是真核細胞處理內源性和外源性DNA堿基損傷的主要修復途徑之一。LP-BER是修復細胞核和線粒體氧化堿基的主要途徑，BER是通過特異性DNA糖基化酶切除受損堿基，然后通過AP核酸內切酶1（APE1）切割DNA骨架而啟動的，這種中間結構可以通過SP-BER或LPBER途徑加工。FEN1在LP-BER中起著核心作用，對維持基因組的穩定性和完整性是必不可少的。FEN1是一種結構特異的核酸酶，具有5‘翻蓋內切酶(FEN)、5’-3‘外切酶(EXO)和間隙核酸內切酶(GEN)活性。在小鼠模型中，缺乏Gen和EXO活性的FEN1突變會導致肺腺瘤的高發病率，FEN1的功能缺陷與人類癌癥風險增加之間也存在聯系。

盡管在多種癌癥中發現了許多其他DNA修復基因的體細胞突變，但FEN1突變非常罕見，這表明FEN1對正常的DNA新陳代謝很重要。近來在人結腸癌標本中發現了4個FEN1中體細胞的、非同義的、雜合性的單核苷酸替換，它們分別是：E20D、L209P、R245G和S329N。確定這些突變是否會影響FEN1的功能并促進癌癥的發生和發展，這一點很重要。

● 研究結果

1. L209P變異在結腸癌中的發生

FEN1對于維持基因組DNA的穩定性和完整性很重要，研究者推測FEN1功能缺失突變可能會導致癌癥的發生和發展。癌癥基因組數據庫檢索發現，大多數癌癥類型的腫瘤組織中都存在雜合的FEN1體細胞突變，33例結直腸癌患者的FEN1突變頻率最高(圖1A)。已在結直腸癌中檢測到四個FEN1突變，分別是E20D、L209P、R245G和S329N(圖1B)。研究者重點研究了L209P突變，因為它位于核心核酸酶域(圖1C)，并且在進化上是保守的。為了預測L209P突變對FEN1活性和DNA底物結合的影響，研究者進行了生物信息學分析。結果表明，L209P突變會導致FEN1活性喪失，但并沒有明顯改變FEN1/DNA的相互作用，這與觀察到的其不影響DNA結合的結果一致。為了部分驗證這一預測，在大腸桿菌中表達了FEN1 L209P和WT，并將其純化為均一(圖1E)。圓二色譜分析結果顯示L209P FEN1蛋白在22℃時與WT FEN1蛋白的構象幾乎相同(圖1F)，表明脯氨酸到亮氨酸的轉變對蛋白質構象沒有明顯影響。為了研究L209P突變是否影響FEN1的熱穩定性，研究者還在37°C進行了圓二色譜分析(圖1G)。結果表明，L209P FEN1的整體結構與WT FEN1相似，說明FEN1的熱穩定性不受L209P突變的影響。

圖1

2. FEN1 L209P突變體缺乏三種核酸酶活性

為了進一步驗證預測和評估L209P突變對FEN1生化活性的影響，研究者使用合成的DNA底物在體外檢測了L209P FEN1的FEN1的FEN、EXO和GEN活性。正如圖1D所預測的那樣，當在37°C測定時，L209P突變幾乎完全消除了FEN1的三種活性(圖2A-C)。由于L209P和WT FEN1在22°C和37°C具有相同的整體結構，因此L209P FEN1活性的缺陷不太可能是由于L209P蛋白對溫度的敏感性造成的。

圖2

3. L209P FEN1保持完整的DNA底物結合能力

由于L209P FEN1與WT FEN1具有相同的整體結構(圖1f)，因此全局結構缺陷不太可能是L209P FEN1活性降低的原因。研究者使用凝膠偏移(圖3A、C和E)和酶聯免疫吸附(ELISA)分析(圖3B、D和F)來確定FEN1-DNA結合親和力。兩種檢測方法均顯示L209P變異體與WT FEN1的DNA結合親和力無差異。這一結果與之前的觀察結果一致，即只有帶正電荷的氨基酸，如第70、245和327位的精氨酸，以及第244、252和326位的賴氨酸，才直接參與FEN1-DNA的相互作用。

圖3

4. L209P FEN1干擾WT FEN1核酸酶活性

由于L209P FEN1具有完整的DNA底物結合親和力，研究者推測L209P FEN1的存在可能干擾了WT FEN1的活性。為了驗證這一假設，研究者將不同數量的每種蛋白質與DNA底物混合，并測定了它們的FEN(圖4A)、EXO(圖4B)和GEN(圖4C)活性。當L209P FEN1與WT FEN1共同孵育時，WT FEN1的活性被抑制。L209P FEN1對WT FEN1的抑制作用呈劑量依賴性。這些結果表明，L209P對WT FEN1的活性呈顯性抑制。

圖4

5. L209P FEN1突變干擾BER效率

剝離結構的去除是完成LP-BER的關鍵步驟。L209P FEN1活性降低提示該突變可能影響了LP-BER功能。為了驗證這一假設，研究者使用純化的蛋白進行了LP-BER分析。結果顯示在存在WT FEN1而不是L209P FEN1突變體的情況下，THF的損傷得到了有效的修復(圖5A)。為了驗證L209P FEN1是否干擾WT FEN1的整體BER效率，研究者將純化的L209P FEN1與WT FEN1蛋白混合進行LP-BER分析。結果表明，在L209P FEN1蛋白存在的情況下，BER效率降低(圖5B)。此外，研究者使用SW480細胞提取物（含或不含其他L209P FEN1蛋白）進行LP-BER，以確定L209P FEN1是否會在細胞提取物環境中損害BER。結果顯示，雖然SW480細胞提取物可以有效修復THF損傷，但在細胞提取物中加入L209P FEN1會降BER率效率(圖5C)。為了模擬在人結腸癌細胞中檢測到的FEN1雜合L209P體細胞突變，研究者在也含有內源性WT FEN1的SW480細胞中過表達L209P FEN1或WT FEN1，結果表明，表達L209P FEN1的細胞提取物的BER遠低于表達WT FEN1的細胞提取物(圖5D)。上述數據表明，在SW480細胞中純化或表達的L209P FEN1干擾WT FEN1的BER活性。

圖5

6. L209P FEN1的表達增強細胞對DNA損傷的敏感性

為了研究L209P FEN1變異體在細胞中可能的生物學功能，研究者用含L209P或WT FEN1基因的慢病毒載體轉染SW480結腸癌細胞。結果顯示，轉染L209P FEN1的細胞比轉染WT FEN1或轉染親本對照SW480的細胞對5-FU或H2O2更敏感，表明含L209P FEN1的細胞LP-BER修復存在缺陷(圖6A和B)。熒光激活細胞分選分析比較5-FU和H2O2誘導的細胞凋亡率，結果顯示，經5-FU或H2O2處理后，表達FEN1的細胞的凋亡率明顯高于表達WT FEN1或親本SW480的細胞(圖6C)。用細胞凋亡標志物Caspase-3的抗體進行細胞染色，也證實了熒光激活的細胞分選結果(圖6D和E)。這些數據支持了以前的報道，即DNA損傷如果不修復，可能會導致細胞凋亡。然而，由于DNA損傷的積累和基因組的不穩定，非凋亡處理的細胞可能更容易轉化。

圖6

7. L209P引起內源性DNA損傷和染色體畸變

除了外源性物質的損傷外，DNA損傷也可能是代謝或水解過程的自然反應。因此，研究者預計L209P細胞比WT細胞表現出更高的內源性DNA損傷水平。為了驗證這一假設，研究者檢測了H2AX組蛋白磷酸化形式(DNAH2AX)的水平，該蛋白是細胞對γ斷裂反應的早期標志物。在沒有外源性γ損傷的情況下，L209P細胞磷酸化DNAH2AX的基礎水平高于WT細胞(圖7A)。此外，在γH2AX抗體染色的細胞中可檢測到DSB的核病灶。結果顯示，含L209P FEN1細胞的γH2AX陽性核數量多于WT細胞(圖7B)。結果表明，L209P FEN1的表達導致DNA雙鏈斷裂的積累。接下來，為了弄清染色體不穩定是由于DNA單鏈斷裂(SSB)在S期轉化為DNADSB，還是由其他復制缺陷引起的，研究者將細胞與抗53BP1(腫瘤抑制因子p53結合蛋白1)和CENPF(著絲粒蛋白F)的抗體共染色。53BP1是DSB修復的關鍵調節因子，53BP1病灶的形成提示DNA復制效率低下/有缺陷。結果顯示，在沒有外源性DNA損傷來源的情況下，G2中53BP1焦點顯著增加(圖7C)，表明自發損傷是由未修復的SSB碰撞引起的。然而在G1(CENPF陰性細胞)中也觀察到53BP1病灶的增加(圖7D)，表明L209P FEN1也會導致DNA復制缺陷。

圖7

為了檢測Lp-BER在體內表達L209P的細胞中是否受到抑制，研究者進行了堿性彗星試驗，評估了彗星事件在確定的DNA碎裂階段的總體分布(圖7E)。這些階段包括沒有DNA斷裂的細胞(階段I)到DNA嚴重斷裂的細胞(階段V)。不經H2O2處理的SW480細胞顯示，表達L209P FEN1的SW480細胞的自發DNA鏈斷裂水平相對高于WT細胞(階段III和IV，圖7F)。H2O2處理后，所有細胞系均顯示出嚴重的DNA損傷(圖7F)。而表達L209P FEN1的細胞顯示出比表達WT FEN1的細胞更強的DNA損傷。對彗星階段分布的研究證實，L209P FEN1突變導致了LP-BER的缺陷，以及Okazaki片段的成熟。

BER缺陷會導致BER中間體的顯著積累(圖7A-D)，這將導致染色體畸變。為了測試表達L209P FEN1的細胞是否比表達WT FEN1的細胞和親本SW480對照細胞積累了更多的染色體斷裂，研究者分析了中期細胞核的染色體畸變，結果顯示與表達WT FEN1的親本細胞和對照親本細胞相比，表達L209P FEN1的細胞染色體片段和斷裂水平顯著增加(圖8A)。這一結果表明L209P FEN1的表達確實導致了細胞基因組的不穩定。

8. L209P誘導細胞轉化

有報道稱非整倍體是癌細胞的標志，因此研究者首先測定了表達FEN1的WT細胞和突變型L209P FEN1細胞的非整倍體率。結果顯示表達L209P FEN1的細胞的非整倍體率幾乎是表達WT FEN1的細胞的4倍(圖8B)。這表明，表達L209P FEN1的細胞自發積累染色體片段，導致染色體不穩定和非整倍體的出現。這些細胞異常可能促進細胞轉化并導致克隆性擴張。為了確定L209P突變是否促進腫瘤的發生，研究者進行了病灶形成和軟瓊脂錨定非依賴性生長試驗，結果表明L209P FEN1細胞比WT FEN1細胞含有更多的轉化細胞。研究者進一步將表達L209P FEN1的細胞、表達WT FEN1的細胞和雙親對照的SW480細胞注射到成年免疫缺陷小鼠體內，結果顯示表達L209P FEN1的腫瘤的生長速率顯著高于WT FEN1和親代對照組的生長速率(圖8C)。腫瘤稱重顯示，表達L209P FEN1的細胞的平均腫瘤重量顯著高于表達WT FEN1的細胞和親本對照細胞的腫瘤重量(圖8D)。這些數據表明，攜帶L209P FEN1突變的細胞比WT細胞更具致瘤性。

 圖8