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中文標題：STAT3的激活在TLR4信號介導的黑色素瘤進展中是一個關鍵事件

發表期刊：Cell Death and Disease

中科院分區：1區

影響因子：9.2

發表時間：2020年

合作單位：香港浸會大學中醫學院

運用技術：慢病毒載體構建，慢病毒包裝（由輝駿生物提供技術支持）

● 研究背景

黑色素瘤起源于神經嵴來源的黑素細胞，是一種侵襲性癌癥，惡化速度快，致死率高。其發病機制十分復雜，到目前為止還沒有完全闡明。盡管目前針對不能切除的黑色素瘤的靶向治療和免疫治療顯示出令人振奮的臨床效果，但這種疾病仍然是無法治愈的。了解黑色素瘤進展的機制將大大促進對抗黑色素瘤的新療法的發展。

Toll樣受體4(TLR4)是一種負責清除病原體的信號分子。它還與包括黑色素瘤在內的多種癌癥的發生有關。脂多糖(LPS)是一種TLR4配體，它能促進TLR4陽性黑色素瘤細胞的增殖和遷移，而對TLR4陰性黑色素瘤細胞則無此作用。然而，TLR4信號介導的黑色素瘤發生機制尚不完全清楚。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是一種轉錄因子，在黑色素瘤中被結構性激活。STAT3的激活/磷酸化導致一組與黑色素瘤生長、血管生成、轉移和免疫逃避有關的基因轉錄。在結腸癌患者的腫瘤組織中，已發現TLR4、MyD88和STAT3的表達呈正相關，然而有關是否存在涉及這三個分子的通路以及其在大腸癌中是否起致病作用尚不清楚。

● 研究結果

1. 人黑色素瘤標本中TLR4表達與STAT3磷酸化呈正相關

為了確定TLR4的表達與STAT3激活/磷酸化的相關性，研究者利用人類黑色素瘤組織(總共208個樣本)進行了免疫組織化學染色(圖1A)。使用H評分系統對蛋白質表達水平進行半定量評估，結果顯示與正常組織相比，黑色素瘤組織中TLR4和磷酸化STAT3(Y705)的蛋白水平顯著升高(圖1B，C)。進一步分析表明，208例黑色素瘤組織中TLR4的表達和STAT3的磷酸化水平呈正相關(圖1D)。在男性和女性患者樣本中也發現TLR4表達和STAT3磷酸化呈正相關；在不同年齡組中，TLR4表達與STAT3磷酸化在中年(40-60歲)和老年(>60歲)患者中呈正相關，而在年輕(<40歲)患者中無相關性。<40歲患者與≥40歲患者觀察結果不同的原因有待進一步探討。總之，TLR4和STAT3在人黑色素瘤組織中的高水平表達和STAT3磷酸化呈正相關，提示TLR4和STAT3在黑色素瘤發病機制中存在聯系。

圖1

2. TLR4配體通過MYD88和TRIF在黑素瘤細胞中激活STAT3

為了確定TLR4信號是否涉及黑色素瘤細胞中的STAT3活化，研究者使用TLR4配體刺激黑色素瘤細胞，并檢測STAT3的磷酸化和核定位。結果表明，兩種TLR4配體LPS和MPLA均能增加多種黑色素瘤細胞系中STAT3的磷酸化水平(圖2A)。一旦STAT3被磷酸化，它就移位到細胞核中，在那里它起到轉錄因子的作用。研究者還發現，LPS增加了STAT3在A375細胞中的核定位(圖2B)，進一步證實了TLR4配體刺激對STAT3的激活。TLR4和TLR2廣泛表達于黑色素瘤細胞，為了確定TLR4對LPS和MPLA誘導的STAT3激活的必要性，研究者用一種特定的siRNA敲除了A375細胞中的TLR4，結果顯示，LPS和MPLA顯著增加了轉染陰性對照(NC)siRNA的A375細胞中STAT3的磷酸化（圖2C，D）。TLR4基因敲除可完全阻斷LPS和MPLA促進的STAT3磷酸化。這些數據證實了LPS和MPLA誘導的STAT3在黑色素瘤中是通過TLR4激活的。

在配體識別時，TLR4信號通過MYD88依賴或TRIF依賴的方式。研究者發現，沉默MYD88或TRIF，就像沉默TLR4一樣，同時取消了LPS和MPLA增強的STAT3磷酸化(圖2C，D)。敲除實驗結果表明MYD88和TRIF都參與了TLR4配體介導的STAT3的激活，此外，TLR4基因的敲除降低了黑色素瘤細胞中STAT3的蛋白水平，但不降低其mRNA水平(圖2C，E)。MyD88或TRIF基因敲除不影響總STAT3蛋白水平(圖2C，E)。這些觀察表明，TLR4信號使用不同的機制來激活STAT3和維持STAT3蛋白的穩定性。

圖2

3. TLR4配體促進STAT3介導的細胞事件在黑色素瘤進展中的作用

已經觀察到TLR4配體增加了STAT3在黑色素瘤細胞中的核定位(圖2B)。RT-qPCR結果顯示，LPS或MPLA刺激黑色素瘤細胞后，BCL2L1和MCL1、參與黑色素瘤轉移和血管生成的MMP-2、MMP-9和VEG的mRNA水平均升高(圖3A)。接下來，研究者在細胞模型中研究了TLR4配體是否觸發了上述基因相關的惡性行為。結果表明，MPLA和LPS以相似的方式促進黑色素瘤細胞的增殖(圖3B)和侵襲(圖3C)。為了檢測黑色素瘤細胞中TLR4信號是否促進血管生成，用MPLA和LPS刺激的A375細胞的條件培養液分別孵育HUVEC，并計數形成的管數。結果顯示，兩種條件培養液均能促進人臍靜脈內皮細胞(圖3D)的管狀形成，表明TLR4信號通路促進了體外血管生成。

MPLA已被臨床測試為治療包括黑色素瘤在內的癌癥的免疫治療劑。研究者發現MPLA能激活黑色素瘤細胞中的STAT3。為了檢驗MPLA是否刺激免疫抑制細胞因子的產生，研究者收集了MPLA處理的A375細胞的條件培養液，并進行了細胞因子陣列檢測。結果顯示，刺激MPLA后，ICAM121、IL-622、CXCL1222、G-CSF23和PAI-124等免疫抑制細胞因子均增加(圖3E，F)。G-CSF可以被TLR4信號上調，并且能夠激活黑色素瘤中的STAT3。ICAM-1、IL-6、CXCL12和PAI1受STAT3轉錄調控。ICAM-1在改變的蛋白中增加最多。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對其進行了定量。結果證實，MPLA能顯著增加ICAM-1的分泌，LPS也能增加ICAM-1的分泌(圖3G)。這些結果表明黑色素瘤細胞中的TLR4信號增加了免疫抑制細胞因子的分泌，這種細胞因子可以被STAT3上調。

接下來，研究者研究了TLR4信號介導的黑色素瘤進展中的細胞事件是否需要STAT3的激活。為此，研究者建立了一對穩定的細胞株B16STAT3β(高表達STAT3β的細胞)和B16NC(含有空載體的陰性對照細胞株)。WB結果顯示，B16STAT3β細胞中針對Bclxl、Mcl-1、VEGF和MMP2的STAT3蛋白水平均低于B16NC細胞(圖3H)，表明STAT3β可阻斷STAT3的激活。細胞功能實驗結果表明，脂多糖和MPLA均能顯著促進B16NC細胞的增殖(圖3I)和侵襲(圖3J)，但對B16STAT3β細胞無明顯影響，提示STAT3的激活在β信號誘導的黑色素瘤進展中起關鍵作用。

圖3

4. 組成性TLR4信號增強STAT3激活促進小鼠黑色素瘤進展

為了確定體內黑色素瘤中TLR4和STAT3之間的關系，研究者建立了一對穩定的細胞系A375CA-TLR4（含有TLR4的組成型活性變體）和A375NC（含有空載體的陰性對照細胞系），然后比較兩種細胞系中的STAT3活性，并進一步比較了A375CA-TLR4和A375NC荷瘤小鼠的腫瘤生長、血管生成和EMT。結果顯示A375CA-TLR4細胞中磷酸化STAT3的蛋白質水平和STAT3的轉錄活性高于A375NC細胞（圖4A，B），表明TLR4的組成型活化增強了黑素瘤細胞中的STAT3活化。EMT是腫瘤細胞侵襲和轉移的早期事件，在A375CA-TLR4細胞中觀察到了EMT樣形態學特征，例如失去細胞間相互作用和紡錘形表型（圖4C），表明TLR4活化促進黑素瘤中的EMT過程。

在A375CA-TLR4和A375NC異種移植小鼠模型中，A375CA-TLR4異種移植瘤的重量比A375NC組重(圖4D)。在A375CA-TLR4腫瘤中，總的和磷酸化的STAT3蛋白水平均上調(圖4E)。腫瘤組織免疫組化染色顯示，A375CA-TLR4腫瘤與A375NC腫瘤相比，Ki-67(細胞增殖標記物)、CD31(血管生成標記物)、N-cadherin(兩種間質標記物)和vientin(波形蛋白)蛋白水平均有升高，E-cadherin(上皮性標記物)水平降低(圖4F)。這些數據表明，TLR4的激活增強了黑色素瘤組織中STAT3的激活，并促進了小鼠腫瘤的生長、血管生成和EMT。

圖4

5. TLR4信號介導的小鼠黑色素瘤進展需要STAT3的激活

接下來，研究者在存在或不存在LPS的情況下分別將懸浮在PBS中的B16NC和B16STAT3β細胞皮下注射到小鼠體內。腫瘤稱重顯示，B16STAT3β腫瘤比B16NC腫瘤更小更輕（圖5A）。此外，LPS促進B16NC腫瘤中的腫瘤生長（圖5A）和STAT3活化（圖5B），但對B16STAT3β腫瘤的影響較小，表明STAT3活化在TLR4信號傳導介導的黑素瘤生長中起積極作用。腫瘤組織的IHC染色顯示，與沒有LPS刺激的B16NC腫瘤相比，LPS刺激的B16NC腫瘤中Ki-67，CD31，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達水平增加，而E-鈣粘蛋白的表達降低（圖5C）。IHC染色結果揭示了STAT3活化在TLR4信號傳導介導的黑素瘤生長、血管生成和EMT中的重要作用。

流式細胞分析結果顯示，LPS刺激增加了B16NC荷瘤小鼠脾髓系來源的抑制細胞（MDSC；CD11b+Gr-1+細胞）的百分比，但對B16STAT3β荷瘤小鼠無明顯影響（圖5D）。MDSC負責免疫抑制，從而限制CD8T細胞的活性和腫瘤浸潤。在LPS刺激下，B16NC荷瘤小鼠脾臟和腫瘤浸潤性CD8(CD3+CD8+)T細胞的百分比顯著降低(圖5D)。在B16STAT3β荷瘤小鼠中，LPS對脾臟CD8 T細胞數量的降低作用弱于B16NC荷瘤小鼠(圖5D)，提示STAT3激活在LPS誘導的脾臟CD8 T細胞減少中起作用。流式細胞分析還顯示，LPS刺激的B16NC腫瘤中NK細胞的數量明顯減少，而沒有LPS刺激的B16NC腫瘤中則沒有（圖5D）。通過在腫瘤中表達STAT3β來阻斷STAT3的激活，可增加腫瘤浸潤的NK細胞，并減弱LPS誘導的NK細胞減少(圖5D)。這些變化提示，在黑色素瘤微環境中，STAT3的激活參與了TLR4信號介導的免疫抑制。

圖5

6. 藥物抑制TLR4/STAT3通路可抑制黑色素瘤細胞的體內外增殖

接下來，研究者使用了在多種癌細胞中抑制TLR4和STAT3通路的天然倍半萜內酯——小白菊內酯，以及TLR4拮抗劑TAK-242，來檢測抑制TLR4/STAT3通路是否會抑制黑色素瘤細胞的增殖。結果顯示，小白菊內酯和TAK-242均呈劑量依賴性地降低A375和B16黑色素瘤細胞的TLR4、STAT3和磷酸化STAT3的蛋白水平，并抑制其增殖(圖6B)。體內實驗結果表明，小白菊內酯呈劑量依賴性地降低腫瘤重量和腫瘤體積，而不影響小鼠的體重。WB結果顯示，小白菊內酯顯著降低B16腫瘤中TLR4、STAT3和磷酸化STAT3的蛋白水平(圖6F)。這些結果均表明，抑制TLR4/STAT3通路是治療黑色素瘤的可行策略。

圖6